Transformation von Agrobacterium Tumefaciens?
Hi,
ich beschäftige mich aktuell mit grüner Gentechnik und genauer mit der Herstellung von Bt-Mais. Ein Weg dafür ist ja die Übertragung eines rekombinanten Plasmids auf das Agrobakterium, das die gewünschte DNA dann in das Genom der Pflanze übertragt.
Meine Frage wäre, wenn ich das rekombinante Plasmid in die Bakterienzelle übertrage, dann ist doch in dieser auch ein "normales" Plasmid enthalten, das halt schon vor der Transformation da war, oder? Oder ist die Zelle auf die das rekombinante Plasmid übertragen wird plasmidfrei?
Das Problem wäre dann doch, das nicht nur die gewünschte DNA auf die Pflanze übertragen wird, sondern auch das Gen, dass die tumorartigen Wucherungen auslöst. Das wäre doch eher kontraproduktiv?
Kann mir jemand genau erklären, wie das rekombinante Plasmid auf das Bakterium übertragen wird oder wo mein Denkfehler liegt. Ich bedanke mich für alle hilfreichen Antworten.
1 Antwort
Hi,
der Laborstamm hat nur noch Plasmide, die kein Tumorwachstum mehr induzieren können. Weil die original T-DNA aus dem Ti-Plasmid entfernt wurde. Man nennt diese Plasmide auch "entschärfte" Plasmide. Von der Seite droht also keine Gefahr.
Der Transfermechanismus für die DNA bei Agrobacterium-Plasmiden funktioniert soweit ich weiß allerdings nur bei zweikeimblättrigen Pflanzen gut, nicht bei einkeimblättrigen, wie z.B. Getreide oder Mais. Daher bin ich mir gar nicht sicher, ob diese Technologie bei Bt-Mais verwendet werden kann. Ich weiß, dass eine oder einige Internetseiten das als Beispiel sogar führen. Aber heute schreibt ja oft der eine vom anderen ab. Wie gesagt, ich bin mir nicht sicher.
Wenn man in die Zulassungsinformation von Bt-Mais schaut, das ist die Maislinie MON810, steht da als DNA-Transfermechanismus "Methode: Transformation mit Partikelkanone" und nicht Transformation durch Agrobacterium tumefaciens.
https://www.transgen.de/kb/619/
Das würde meine Vermutung stützen. Bei dieser Methode wird die DNA einfach auf Goldpartikel geladen und in die Pflanzenzellen hinein geschossen.
https://www.transgen.de/lexikon/1691.partikelkanone.html
Verschiedene Wege führen nach Rom.
Ansonsten sieht man das Ti-Plasmid einmal hier:
Bild: Von Ti plasmid.svg: Mouagip / abgeleitetes Werk: Yikrazuul - Diese Datei wurde von diesem Werk abgeleitet: Ti plasmid.svg:, CC0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=26401696
Der DNA-Transfermechanismus findet sich in Gestalt der vir-Gene. In die Pflanzenzelle übertragen wird nur die T-DNA-Region des Plasmids zwischen "linke" und "rechte DNA-Grenze" gelegen. Da liegen jetzt natürlicherweise auch die Tumorgene, nämlich die für "Auxinsynthese" und "Cytokininsynthese". Das sind Gene für die Herstellung pflanzlicher Hormone. Das Tumorwachstum wird in der Pflanze durch Einschleusung und Aktivierung von Genen für ihre eigenen Wachstumshormone ausgelöst. Wenn man diese Gene rausschneidet ist es mit dem Tumorwachstum vorbei.
Aber das Ti-Plasmid behält dann immer noch seine Fähigkeit, diese T-DNA-Region in eine Pflanzenzelle, bevorzugt von zweikeimblättrigen Pflanzen, zu übertragen.
Was man also macht ist den Bereich zwischen linker und rechter DNA-Grenze durch ein beliebiges Wunschgen zu ersetzen. Um es statt der tumorinduzierenden Gene einzuschleusen. Weil der Transfermechanismus ist einzigartig und war dem Wissen und den Fähigkeiten der Gentechniker Lichtjahre voraus.
Es werden zusammen mit dem DNA-Stück (T-DNA) auch Virulenz-Proteine übertragen, die die Immunfunktion der Pflanzenzelle unterdrücken. Sonst würde dieses DNA-Stück vielleicht nicht lange überleben. Diese Proteine unterstützen außerdem den zielgerichteten Transport in den pflanzlichen Zellkern und die Integration der DNA in die pflanzlichen Chromosomen.
Für einen Gentechniker muss das nahezu an Zauberei gegrenzt haben, bei einem Bodenbakterium solche Fähigkeiten vorzufinden und es war klar, dass man DAS unbedingt selbst nutzen wollen würde. Das wäre ja so ähnlich, als wolle man zum ersten Mal zum Mond fliegen und einer liefert den Weltraumbahnhof, inklusive Rakete und Raumkapsel.
LG
Ja das mit den einkeimblättrigen stimmt. Mittlerweile kann das aber im Labor auch mit dem Bakterium erfolgen. Wenn man die Transformation nun mit einer Genkanone erreichen will, beschichtet man das Mikroprojektil dann mit dem ganzen Plasmid oder nur der gewünschten Expressionskasette? Und sollten die DNA-Stücke dann blunt oder sticky ends haben? (oder ich verstehe etwas ganz falsch)