Hilfe PCR Mastermix Prep - DNA Verdünnung?
Liebe Mitmenschen,
hier eine Frage einer Person mit chronischer Inkompetenz, wenn es um Mathe geht, haha.
Alsooooo, ich möchte morgen wieder eine PCR ansetzen, und möchte 25 Mikroliter insgesamt in meinen Reaction Tubes am Ende haben. Bei einer DNA-Konzentration müsste ich im Endeffekt nur 1,4 Mikroliter DNA pipettieren und das ist mir zu riskant.
Frage 1) Wie verdünne ich das am sinnvollsten? 1:10? (z.B. 10 Mikroliter DNA, 90 Mikroliter Wasser?) Sodass ich 14 statt 1,4 am Ende pipettiere, I guess?
Frage 2) Was ändert sich dann beim Mastermix selbst und beim Mastermix-Anteil für die Reaction Tube? Muss sich der Wassergehalt im Mastermix dann ändern? Und pipettiere ich dann folglich nur 11 Mikroliter vom Mastermix selbst, um bei den gewünschten 25 insgesamt zu landen? Stimmt dann das Verhältnis noch?
Ich bin ehrlich gesagt total überfordert und überfragt.
Wäre sehr dankbar über eure Hilfe und hoffe, es war nicht zu kompliziert formuliert.
Danke im Voraus :)
1 Antwort
Wenn die Stoffmengen- und Volumenberechnungen zum Ergebnis haben, dass 1,4 μL DNA-Lösung mit x μL Mastermix und y μL Wasser zu 25 μL zusammengefügt werden sollen, dann kannst Du nicht einseitig das Volumen der DNA-Lösung durch Verdünnung dieser auf 14 μL erhöhen, wenn das Endvolumen weiterhin 25 μL betragen soll. Es sei denn, dass x ≤ 11 μL ist. Dann braucht es eben weniger oder kein Wasser mehr, welches bereits durch die Verdünnung der DNA-Lösung eingebracht wurde. Vielleicht geht auch eine 1:5 Verdünnung der DNA, von der man 7 μL ins reaction vial pipettiert, wenn nicht mehr als 18 μL Mastermix berechnet wurde (Originalrezept). Du veränderst ansonsten das Verhältnis der Sollkonzentrationen massiv. Pipettierst Du die 1,4 μL DNA-Lösung, nimmst damit einen sehr großen Fehler bei der Volumenmessung in Kauf. Du kannst auch zu 14 μL der verdünnten DNA-Lösung das zehnfache Volumen Mastermix und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 250 μL pipettieren. Nach dem Mischen dann ein Aliquot von 25 μL davon ins reaction vial pipettieren.
Das Verdünnen mit Wasser erscheint mir etwas ungewöhnlich. In der Biochemie und Mikrobiologie habe ich gelernt, dass man dazu vorzugsweise gepufferte Lösungen, wie beispielsweise PBS oder ähnliche verwendet.
die Menge an Wasser, die zusätzlich anfällt bei der DNA-Verdünnung einfach von der Menge an Wasser im Mastermix abziehe.
Das kann natürlich auch eine Lösung sein. Wichtig ist, dass die Konzentrationsverhältnisse im reaction vial stimmen, Das lässt sich auch über die Stoffmengen rechnen. c = n/V
Stelle doch einfach einmal das Rezept (Mischungsvorschrift) ein, wie es sich mit 1,4 μL unverdünnter DNA-Lösung darstellt. Dann kann ich Genaueres zur Vorgehensweise sagen. DNA(1,4 μL)/x μL Mastermix/y μLWasser. Vges = 25 μL
Ich danke dir ganz herzlich, dass du dir die Zeit genommen hast! Eine technische Assistentin aus dem Labor hat vorgeschlagen, dass ich die Menge an Wasser, die zusätzlich anfällt bei der DNA-Verdünnung einfach von der Menge an Wasser im Mastermix abziehe. In dem Fall hätte ich 15,85 Mikroliter Wasser PRO Reaktion und sie meinte, da von diesen 14 Mikrolitern (bei einer 1:10-Verdünnung) 12,6 Mikroliter nur Wasser wären, würde ich diese dann von den 15,85 abziehen und dann das Ergebnis, nämlich 3,25, mit der Anzahl an Reaktionen multiplizieren. Macht das Sinn für dich als Experte?