Ablesen der Basensequenz mit Sanger-Sequenzierung?
Guten Tag
Bei der Sanger-Sequenzierung werden in die PCR-tubes Di-Desoxy-Nucleotide eingefügt, die, wenn sie eingebaut werden, zum Kettenabbruch führen. So entstehen unterschiedlich grosse DNA-Fragmente, die mithilfe von Gelelektrophorese der grösse nach geordnet werden. So weit, so gut. Was ich aber nicht verstehe, ist der Schritt, mit dem man zur eigentlichen Sequenz kommt.
Bei diesem Video verstehe ich alles bis Minute 04:00. Danach nicht mehr, denn aus einem Grund, den ich nicht verstehe, ist die DNA-Sequenz die Abfolge der Stopp-Nucleotide. Warum ergibt das Sinn? Wir wissen doch noch immer nichts über die Sequenz der ursprünglichen DNA-Fragments, das wir mit PCR amplifiziert haben.
Sanger Sequenzierung • Prinzip und Ablauf · [mit Video] (studyflix.de)
1 Antwort
Im ursprünglichen Sanger-Verfahren hast du vier Reaktionsansätze, nämlich für jedes Nukleotid (A, G, T, C) einen. Jeder Ansatz wird auf eine separate Spur des Gels aufgetragen. Anschließend erfolgt die Trennung der Bruchstücke nach Größe. Dann muss man einfach nur noch per Hand die Banden von klein nach groß ablesen.
Beispiel:
Die kleinsten Fragmente sind im Gel am weitesten gewandert. Längere Fragmente sind nicht so weit gewandert. Um die Sequenz zu ermitteln, müssen wir von klein nach groß lesen. In diesem Fall von unten nach oben. Das kleinste Stück, also mit einer Länge von 1 bp, finden wir in der Spur A, also beginnt die Sequenz mit einem A. Das nächstgrößere Stück (2 bp Länge) kommt in Spur T, dann kommt die nächste Bande (bei 3 bp Länge) in Spur G, dann in Spur T usw. Wir können so schrittweise die Sequenz von unten nach oben ablesen: 'ATGTGTGCACGTACA'.
Die vier unterschiedlichen Reaktionsansätze waren nötig, weil es nur einen einzigen radioaktiven Farbstoff gab, mit dem man die Didesoxynukleotide markieren konnte. Hätte man alles in einen Topf geworfen, hätte man die unterschiedlichen Didesoxynukleotide nicht voneinander unterscheiden können. Heute reicht ein Ansatz für alle vier Nukleotide aus, weil man jeden davon mit einem anderen fluoreszierenden Farbstoff markieren kann. Das Auslesen geschieht heute auch nicht mehr per Hand, sondern wird von den Sequenziergeräten automatisch durchgeführt, indem ein Laserstrahl durch die Probe geschickt und dann das Fluoreszenzsignal gemessen wird. Das Ergebnis ist dann ein Chromatogramm, in dem die verschiedenfarbigen Peaks für ein bestimmtes Nukleotid stehen. Auch hier ein Beispiel:
In diesem Fall steht magenta für G, rot für T, blau für C und grün für A. Der erste Peak (gelesen wird von links nach rechts) ist rot, dann folgen zwei magentafarbene, ein roter, ein blauer, ein grüner usw. Die Sequenz ist also 'TGGTCATAGCTGTTTCCTG'.
