DNA Sequenzierung nach Sanger, warum sind die Primer radioaktiv markiert?
Hallo, kann mir jemand erklären, warum die Primer bei der DNA Sequenzierung nach Snager radioaktiv markiert sein müssen ?
Dankeschön:)
1 Antwort
Hi,
die vier Fragmentgemische werden bei der Sangersequenzierung parallel im Gel aufgetragen (Spuren: A, T, G, C) und durchlaufen die Elektrophorese. Nun will man ja wissen, wo in den 4 Spuren, DNA-Fragmente gleicher Länge, mit einem entsprechenden Kettenabbruchnukleotid ("ddNTP") liegen. Wenn die Primer 5'-radioaktiv markiert sind, kann man sie im Autoradiogramm, durch Schwärzung von Röntgenfilm, sichtbar machen und erhält dann ein typisches Bandenmuster, an dem man die Abfolge der "Kettenabbruchbasen" und somit die schrittweise Abfolge (Sequenz) der synthetisierten DNA ablesen kann:
Bildquelle: wikipedia, credits: John Schmidt, Lizenz: CC BY-SA 3.0, link: https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=1584721
In dem Bild eines radioaktiv markierten Gels einer Sangersequenzierung, sieht man, leiterartig, die Banden von jeweils gleich langen DNA-Fragmenten, die an ihrem Ende ein bestimmtes von 4 ddNTP's tragen, die in den jeweiligen Spuren gelaufen sind (A, T, G oder C). Wenn man nun, wie in diesem Beispiel angedeutet, die Banden von unten nach oben abliest, dann findet man eine C-Bande in der C-Spur, als nächstes eine G-Bande in der G-Spur, als nächstes eine A-Bande in der A-Spur, dann eine T-Bande in der T-Spur, u.s.w. Die Sequenz der gebildeten (komplementären) DNA zur Original-DNA lautet für dieses Stück also "C-G-A-T". LG
