Wie ist der letzte Schritt zu verstehen der Neukombination?
2 Antworten
Beim Herstellen der Plasmide mit der rekombinanten DNA (in der Abb. nach der Ligierung in der Mitte) nehmen nicht alle Plasmide die rekombinante DNA auch wirklich auf. Manche Plasmide schließen sich wieder, ohne dass sie die rekombinante DNA aufgenommen haben (in der Abb. nach der Ligierung ganz links). Auch kann sich die rekombinante DNA zu einem ringförmigen Molekül schließen, ohne dass sie in das Plasmid aufgenommen wurde (rechts). Um herauszufinden, ob und wenn ja, welche Bakterien das rekombinante Plasmid aufgenommen haben, ist deshalb eine Selektion erforderlich. Eine Möglichkeit ist die Blau-Weiß-Selektion. Eine andere die Selektion mit Antibiotika. Diese ist hier dargestellt.
Das Plasmid wird so designt, dass es zwei Resistenzgene gegen zwei Antibiotika enthält: Ampicilin (hier das grüne Gen) und Tetracyclin (orange). Die Schnittstelle wird so gewählt, dass die rekombinante DNA (rot) in das Tetracyclinresistenz-Gen inseriert wird. Dadurch verliert das Tetracyclin-Resistenzgen seine Wirkung. Das Ampicilin-Resistenzgen bleibt davon unberührt.
Für die Selektion werden nun Bakterien auf einen Nährboden mit Ampicilin ausplattiert und dann im Brutschrank inkubiert. Weil der Nährboden Ampicilin enthält, können auf diesem nur die Bakterien Kolonien bilden, die überhaupt ein Plasmid aufgenommen haben. Die Bakterien, die lediglich die zirkularisierte Säuger-DNA aufgenommen haben, besitzen ja das Resistenzgen nicht und können keine Kolonien bilden.
Im nächsten Schritt gilt es noch herauszufinden, welche der Bakterien lediglich das Plasmid aufgenommen haben und welche tatsächlich auch die rekombinante DNA enthalten. Das macht man, indem die Bakterien mittels Stempelverfahren auf ein zweites Nährmedium mit dem Antibiotikum Tetracyclin ausplattiert werden. Die Bakterien, die hier ebenfalls Kolonien bilden können, besitzen das intakte Tetracyclin-Resistenzgen, haben also keine rekombinante DNA. Die Kolonien mit der rekombinanten DNA sind also die, die auf Ampicilin Kolonien bilden können, auf Tetracyclin jedoch nicht.
Du zerstörst durch die Insertion der neuen DNA, die Resistenz gegen Tetrycycline. Folglich sind alle Bakterien nicht mehr immun dagegen. Die Kontrollgruppe bleibt hingegen immun gegenüber beiden Antibiotika.
wie ist das mit der zirkularisierten DNA und Original Plasmid zu verstehen?