Wie berechnet man die Hybridisierungstemperatur für Primer?
2 Antworten
Die Tools geben immer an wie die Schmelztemperatur TM berechnet wird.
Hier ist mal ein Beispiel für eine ganz simple Annäherung
http://insilico.ehu.es/tm.php?formula=basic
In der Regel nutzt man allerdings etwas ausgereiftere Tools, deren Formeln weitere Variablen enthalten (benachbarte Basenpaare, Pufferzusammensetzung...).
Für die meisten 0815-Anwendung ist es ohnehin nicht wichtig die exakte TM zu kennen, da eine grobe Näherrung ebenfalls zum Ziel führt.
*EDIT: Ich sehe grade, wenn man das Häkchen bei "Base-Stacking TM" im Link clickt bekommt man auch eine gute Näherung des TM
Dafür gibt es viel gute Software, aber auch eine komplizierte Formel, die ich allerdings nicht auswendig weiß
Wichtig bei den beiden Primern ist daneben auch, dass ihre 3'-Enden nicht gegenseitig komplementär sind, ob man jetzt 2, 3, 4 Basen "gegeneinanderrutscht". Sonst amplifizieren sich nämlich die Primer selbst, also ohne Zwischensequenz ...
Ich versuche es mal an einem Beispiel: wenn man so unvorsichtig wäre, die beiden Primer als:
Primer 1 = 5'-GACTTAGATTCGTCAGTTAGATC-3' und
Primer 2 = 5'-TTATGTAGGCCGTACGTAGTCGA-3'
auszuwählen, dann sind das TC am Ende von Primer 1 und das GA von Primer 2 komplementär. da das T (vorletzte Base von Primer1) mit dem A (letzte Base von Primer 2) paaren kann und das C (letzte Base von Primer 1) mit dem G (vorletzte Base von Primer 2)
Denn die Primer lagern sich dann wie folgt aneinander:
5'-GACTTAGATTCGTCAGTTAGATC-3'................................................
..................................................3'-AGCTGATGCATGCCGGATGTATT-5'
und dann werden von den 3'-Enden aus die beiden Primer vervollständigt, es entstünde also der folgende Doppelstrang:
5'-GACTTAGATTCGTCAGTTAGATCGACTACGTACGGCCTACATAA-3'
3'-CTGAATCTAAGCAGTCAATCTAGCTGATGCATGCCGGATGTATT-5'
Dann binden in der nächsten Ampplifizierungsrunde die beiden Primer wieder und die "Doppel-Primer-Sequenz" wird ein weiteres mal verdoppelt.
Viele Grüße, gruenefeder
Kannst du noch mal dieses "amplifizieren" erläutern bzw was genau bedeutet das für das PCR wenn die Primer komplementär sind?