PCR-Reaktionszusammensetzung - Rechenaufgabe, Chemie, kann jemand aushelfen?

Folgende Aufgabe hat mich etwas überrumpelt, weil ich länger keine Rechenaufgaben bearbeitet habe:

Es soll 50 µL einer PCR-Reaktion zusammengemischt werden.

Ausgangskonzentrationen sind: 200 ng/µL DNA-Templat, 10 µM Primer 1+2, 10 mM dNTPs, 5x Reaktionspuffer, 5 U/µl Polymerase-Enzym

Die Reaktion soll folgende Zusammensetzung haben: 50 ng DNA, 0.1 µM Primer, 250 µM dNTPs, 1.25 U Polymerase in Reaktionspuffer

Gesucht sind die Volumina der einzelnen Komponenten inklusive H2O

Answer 1

[Picus48]

DNA-Templat

Das hat die Ausgangslösung die Massenkonzentrationkonzentration von β_i = 200 ng/µL. Im Reaktionsansatz soll die Masse m von 50 ng vorliegen. Die Massenkonzentration β_i ist definiert als Quotient aus der Masse m_i einer betrachteten Mischungskomponente i und dem Gesamtvolumen V der Mischphase:

β_i = m_i /V

Mit m_i = 50 ng und β_i = 200 ng/µL

V = m_i /β_i = 50 ng/(200 ng/µL) = 0,25 µL

Das ist ein Volumen, welches man üblicherweise nicht vernünftig pipettieren kann. Daher würde ich die Ausgangslösung zunächst einmal mit dem Faktor 40 verdünnen. Dazu werden 10 µL der Ausgangslösungmit 390 µL Puffer auf auf 400 µL verdünnt. Die verdünnte Lösung hat dann:

β_i = 5 ng/µL

Von dieser so verdünnten DNA-Lösung werden 10 µL (entsprechen 50 ng) in das Reaktionsvial pipettiert.

Primer

Die Ausgangskonzentrationen sind jeweils:

c = 10 µmol/L

und sollen im Reaktionsvial 0,1 µmol/L sein. Es muss also eine Verdünnung mit dem Faktor 100 erreicht werden. Bei 50 µL Reaktionsvolumen muss von den Primern daher jeweils 0,5 µL in das Reaktionsvial pipettiert werden. Auch hier würde sich eine vorherige Verdünnung auf das 10-fache Volumen anbieten. Von diesen Verdünnungen würden jeweil 5 µL eingesetzt.

dNTPs.Lösung

Ausgangangskonzentration c = 10 mmol/L, Sollkonzentration c = 0,250 mmol/L

Hier muss also ein Verdünnungsschritt mit dem Faktor 40 erfolgen. Bei 50 µL Reaktionsvolumen wären 1,25 µL zu pipettieren. Es ist auch hier ratsam, eine Vorverdünnung mit Puffer vorzunehmen. Beispielsweise 10 µL mit 70 µL auf 80 µL. Von dieser 1:8 Verdünnung werden dann 10 µL in das Reaktionsvial gegeben.

Polymerase-Enzym

Ausgangskonzentration 5 U/µL, Sollkonzentration 1,25 U/50 µL. Es muss hier rechnerisch 0,25 µL in das Reaktionsvial pipettiert werden. Auch hier sollte eine geeignete Vorverdünnung mit Faktor 1:40 erfolgen und davon 10 µL in den Reaktionsansatz gegeben werden.

Wasser

V = 50 µL - Summe der berechneten übrigen Volumina.

Bitte selber nachrechnen!

Comments

[Mayonaise1998]

Ich habe die Rechenschritte nachvollziehen können. Danke für die Erläuterung.