Warum sind moderne DNA- Sequenzierungsverfahren schneller?
Hi,
Warum sind moderne Sequenzierungsverfahren mit Fluoreszenzfarbstoffen und Detektoren schneller als die klassische Gelelektrophorese?
1 Antwort
Mit der Gelelektrophorese selbst kann man ja nur DNA-Schnipsel der Grösse nach sortieren. Nur wenn die Schnipsel aus einer Kettenabbruchsynthese wie beim Sanger-Sequencing stammen, sagt diese Reihenfolge etwas über die Basensequenz aus. Man braucht also 2 getrennte Arbeitsschritte. Ausserdem gibt es die Kettenabbruchsynthese auch mit Fluoreszenzmarkierung (und Detektor). Ich verstehe die Frage daher so:
Warum sind Methoden der 2. Generation (Sequencing by Synthesis, z.B. Illumina) "schneller" als die der 1. Generation (Kettenabbruchsynthese + Gelelektrophorese)?
Dann lautet die Antwort:
- Automatisierung: Synthese und Sequenzierung passieren in einem Schritt, d.h. der Detektor liest das Fluoreszenzsignal während die Synthese des neuen Moleküls „in Echtzeit“ aus. Ein Transfer zwischen Geräten entfällt und der ganze Prozess kann leicht automatisiert werden.
- Miniaturisierung und Parallelisierung: Die zu sequenzierenden Moleküle werden am Boden des Reaktionsgefässes fixiert, d.h. ihre Identität ist durch ihre Position bekannt (erleichtert auch die Automatisierung). Daher ist es aber v.a. auch möglich, über tausend verschiedene Sequenzen in der gleichen Reaktion (bzw. in einem Durchgang) zu bestimmen.
- Auch wichtig: Die verwendeten Nucleotid-Analoga sind ebenfalls "Abbruchnucleotide". Aber nicht, weil ihnen die 3'-Hydroxygruppe fehlt (wie bei Sanger), sondern weil ihre 3'-Hydroxygruppe durch eine Schutzgruppe blockiert ist. Diese Schutzgruppe kann man abspalten, damit die Kettenverlängerung wieder möglich ist. D.h. der Kettenabbruch ist reversibel, was die ganze Methode erst möglich macht.
Wenn man also sagt, die neuere Methode sei „schneller“, ist damit gemeint, dass der Durchsatz höher ist. Jede Einzelreaktion (Einbau eines einzigen Nucleotids), dauert sogar länger als bei der 1. Generation, aber weil man tausende Sequenzen gleichzeitig im gleichen Gefäss machen kann, hat man am Ende des Tages viel mehr Sequenzen bestimmt.
LG, TheGuyOfReason
