welche Schritte sind notwendig, um Bakterien Kolonie zu erhalten, die das gewünschte Fremdgen enthalten?
3 Antworten
Du hast zunächst ein ringförmiges DNA-Molekül (Plasmid), in welches das zu klonierende Gen, z. B. ein humanes Insulingen, eingefügt werden soll. Schritt 1 ist deshalb ein Restriktionsenzymverdau. Das geschieht, indem Restriktionsenzyme das Plasmid an einer ganz bestimmten Stelle aufschneiden. Eines dieser Restriktionsenzyme ist z. B. EcoR1. Es heißt so, weil man es zuerst in E. coli entdeckt hat. Bakterien setzen Restriktionsenzyme eigentlich dazu ein, um fremde DNA (etwa von Bakteriophagen, also Viren, die Bakterien befallen) unschädlich zu machen.
Das Plasmid ist nun also geöffnet (linearisiert) und das zu klonierende Gen kann anhand der überhängenden Enden (sticky ends) passgenau an die Schnittstelle angefügt werden (es gibt auch Restriktionsenzyme, die glatte Enden (blunt ends) schneiden). Das Plasmid schließt sich dann wieder, es wird wieder ringförmig (zirkularisiert). Beim Einfügen hilft das Enzym Ligase. Allerdings hat man nicht nur ein Plasmid, sondern viele und bei den meisten schließt sich der Ring wieder, ohne dass das Gen eingefügt wurde. Wir haben nun also eine Mischung aus Plasmiden, die das Gen enthalten und aus Plasmiden, die es nicht enthalten.
Der nächste Schritt ist die sog. Transformation. Das heißt, dass das Plasmid in die Bakterien eingeschleust wird. Es gibt verschiedene Methoden dafür, z. B. den Beschuss mit feinsten Goldpartikeln oder eine elektrische Behandlung der Zellen, die die Zellmembran kurzzeitig durchlässig macht. Nach der Transformation werden die Bakterien auf einer Nährschale inkubiert und bilden Kolonien.
Wir haben nun eine Petrischale, die verschiedene Bakterienkolonien beinhalten. Bei manchen hat allerdings die Transformation nicht geklappt, d. h. sie haben kein Plasmid aufgenommen. Andere haben vielleicht ein Plasmid aufgenommen, aber so eines, das das zu klonierende Gen nicht enthält, das sich also einfach so wieder geschlossen hat. Deshalb müssen wir nun die Bakterien herausfiltern, bei denen die Transformation erfolgreich war.
Zunächst wollen wir erst mal all die Bakterien aussieben, die gar kein Plasmid aufgenommen haben. Dafür haben wir in das Plasmid vorher ein Resistenzgen eingefügt gegen das Antibiotikum Ampicillin. Heißt also: Bakterien, die kein Plasmid aufgenommen haben, sind nicht gegen Ampicillin resistent. Wir nehmen mit einem Stempel einen Abdruck und überführen diesen auf eine zweite Petrischale, die im Nährmedium das Antibiotikum Ampicillin enthält und inkubieren diese wieder. Dann können wir vergleichen. Überall dort, wo auf der Schale mit Ampicillin Kolonien wachsen, hat eine Transformation insofern stattgefunden, dass das Plasmid aufgenommen wurde.
Nun wollen wir ja aber noch herausfinden, welche Bakterienkolonien tatsächlich auch das zu klonierende Gen enthalten. Um das herauszufinden, gibt es z. B. die sog. Blau-Weiß-Selektion. Hier hat man ein anderes, aber ähnliches Verfahren gewählt. Unser Plasmid enthielt noch ein zweites Resistenzgen, gegen das Antibiotikum Tetracyclin. Und die Schnittstelle für das Restriktionsenzym liegt genau in diesem Resistenzgen. Das bedeutet, wenn das zu klonierende Gen wirklich erfolgreich ins Plasmid eingesetzt wurde, ist das Tetracyclin-Resistenzgen funktionslos geworden. Wir überführen also einen weiteren Stempelabdruck auf eine dritte Platte, die Tetracyclin enthält und inkubieren wieder. Dann vergleichen wir wieder mit der ersten Platte. Und können dann als Ergebnis ziehen, dass auf unserer ersten Plattegenau jene Bakterienkolonien erfolgreich transformiert wurden, deren Abdruck auf der Platte 2 mit Ampicilin wächst und auf Platte 3 mit dem Tetracyclin nicht. Von diesen Kolonien kann man dann einen Abstrich nehmen und mit diesem dann weitere Platten in Reinkultur beimpfen.
Die Erklärung von Darwinist ist vollkommen korrekt, nur ein paar Anmerkungen für die Praxis:
Nach der Transformation werden die Bakterien dierekt auf eine Selektionsplatte gegeben (also hier mit Ampicillin). Bei einer üblichen Transformationsrate von 1:1000 bis 1:10000 ist ein überstempeln wenig effizient wenn man bedenkt, dass eine übliche Petrischale ca. 300 Kolonien enthalten kann. Man müsste also mind. 4 Platten überstempeln um auch nur eine Kolonie mit einem Plasmid zu haben und die hat wahrscheinlich dann nicht einmal das gewünschte Gen.
Um ein überstempleln gänzlich unnötig zu machen, haben viele Plasmide statt der Tet Resiszenz ein Gen, dass die Kolonien auf bestimmten Platten blau werden lässt (die von Darwinist erwähnte blau weiss Selektion), man nimmt also nur die weissen Baterien um weiter zu arbeiten. Alternativ gibt es Plasmide, die neben einem Antibiotikaresistenzgen, ein Gen tragen dessen Produkt für das Empfängerbakterium tödlich ist. So wachsen auf (in diesem Fall Amicillin) Selektionsnährböden nur die Baterien die ein Plasmid haben in das etwas "eingebaut" wurde.
1. Ring (ich schätze, das ist ein Plasmid) mit Restriktionsenzymen aufschneiden -> sticky ends
2. einzubauendes Gen auch schneiden, sodass sticky ends entstehen, die genau zu den sticky ends des Plasmids passen
3. Beides zusammenkippen, dann werden manche Ringe das Fremdgen aufnehmen (aber nicht viele, manche schließen sich einfach wieder!)
Um sicherzugehen, dass nur Plasmide in der Kolonie sind, bei denen der Einbau geklappt hat, kann man zusammen mit dem Fremdgen noch ein Resistenzgen (z.B. Kanamycinresistenz) einbauen. Wenn du dann Kanamycin dazukippst, sterben alle Plasmide ab, bei denen der Einbau nicht erfolgreich war.
-> Die Kolonie enthält nur noch Bakterien/Plasmide, die das Fremdgen enthalten.