Genrekombination mithilfe eines Polylinkers (MCS)
Hi, ich habe eine spezielle Frage die sich auf Gentechnik bezieht...
Das Plasmid pUC18 enthält einen Polylinker (auch Multiple Cloning Site = MCS genannt) in einem Markergen namens LacZ, dass die α-Untereinheit der β-Galactosidase codiert. Ein Polylinker ist ein etwa 50 Basenpaare große Sequenz, die mehrere Schnittstellen für Restriktionsenzyme enthält. Bei der Blau-Weiß-Selektion wird ein gewünschtes DNA-Fragment mit dem Plasmid rekombiniert, indem es mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten wird wie die MCS, sodass (z.B. im Falle von EcoRI) "klebrige Enden" entstehen und somit Plasmid und Insert verknüpft werden können. Die Blau-Weiß-Reaktion dient zum Nachweis, dass das vom Bakterium (z.B. E.coli) aufgenommene Plasmid tatsächlich rekombiniert wurde, da durch die Insertion des DNA Fragments in das LacZ-Gen die Galactosidase als Genprodukt nicht mehr funktionsfähig ist. Daher kann das Substrat der Galactosidase (X-Gal) nicht mehr zu dem blauen Farbstoff 5,5'-Dibrom-4,4'-dichlor-indigo umgewandelt werden, sodass die Kolonien weiß anstatt blau sind.
Meine Frage bezieht sich auf folgendes Problem: Müsste durch den Einbau der MCS in das LacZ-Gen an sich nicht schon das Leseraster des Gens verschoben und somit die Glactosidase funktionslos sein?
Dieses Problem könnte natürlich umgangen werden, wenn die MCS eine Länge hätte, die einem Vielfachen von 3 entspricht und genau zwischen zwei Basentripletts eingebaut würde. Dann würde aber allerdings das Problem bestehen bleiben, dass die Galactosidase ein paar Aminosäuren zu viel besitzt. Bei einer MCS-Länge von 48 Basenpaaren wären das immerhin 16 zusätzliche AS. Das müsste doch zu einem Funktionsverlust führen oder zumindest zu einer Einschränkung der Funktion, je nach dem, wo genau die MCS in das LacZ-Gen eingefügt wurde, oder nicht? Oder gibt es im LacZ-Gen (bzw. in der Galactosidase) eine Stelle, in der eine Insertion von zusätzlichen Basen (bzw. Aminosäuren) keinen Einfluss auf das Protein hat?
Ich würde mich über ein paar hilfreiche Antworten sehr freuen ;-) Vielleicht hab ich auch nur einen Denkfehler oder die ganze Sache falsch verstanden Danke im Voraus!
2 Antworten
Mit Blue-White Screening kenne ich mich nicht gut aus, weil ich es selber nie gemacht habe. Ich habe meist Vektoren verwendet, die speziell für den Einbau von PCR-Produkten konstruiert waren (TOPO TA Cloning Kit oder TA Cloning Kit von Invitrogen). Da braucht man kein Blue-White Screening, da bei Ampicillin bzw. Kanamycin enthaltenden Nährmedien überhaupt keine Kolonien wachsen, wenn kein Insert eingebaut wurde.
So wie ich das verstehe ist der Ort des Einbaus der MCS im PUC18 Vektor so gewählt (wahrscheinlich empirisch), dass die kurze im richtigen Leserahmen mittranslatierte Sequenz am N-Terminus der ß-Galactosidase keinen großen Einfluss auf die Funktion des Enzyms hat.
Wird aber ein Insert einkloniert so ist das ja meist schon etwas größer und damit sowohl die Primär- als auch die Sekundärstruktur so stark verändert, dass das Enzym nicht mehr richtig funktionieren kann. Am besten ist es natürlich, wenn man ein Insert so wählt, dass der anschließende Leserahmen der ß-Galactosidase sich verändert. Dann ist man ganz auf der sicheren Seite.
Ich bin mir nicht ganz sicher was genau du wissen möchstest aber ich versteh deine Frage nun so. Die MCS steht dem Gen im Weg? Auch im puc 19 ist die MCS in der Mitte von der codierenden Sequenz. Anscheinend stört die gar nicht beim ablesen (Hat meine Leherin damals gesagt)
Ja genau, ich dachte mir, dass die MCS (die ja aus ca. 50 bp besteht) das Leseraster des Gens stört oder zumindest einige Aminosäuren zum Genprodukt (der Galactosidase) hinzufügt, und dieses infolgedessen eigentlich funktionsunfähig sein oder nur eingeschränkt funktionieren solte. In der Praxis scheint es ja tatsächlich so zu sein, dass die MCS nicht stört, aber mir ist eben nicht ganz klar warum das so ist^^
Ich schätze das die RNA-Polymerase das berücksichtigen bzw erkennen kann und es später beim produzieren des genproduktes nicht stört, also der kleine Abschnitt an bp. Daher benutzt man puc18/19 gern für nachweise ob etwas reinkloniert werden konnte ^^ Man könnte sagen der Zufall hat das gut hinbekommen oder Gott hat es genial erschaffen ;D
Ich habe mir so etwas in der Art schon gedacht, wollte aber mal sicher gehen ob die Vermutung korrekt ist. Vielen Dank für deine Antwort! :-)