Genrekombination mithilfe eines Polylinkers (MCS)

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Vom Fragesteller als hilfreich ausgezeichnet

Mit Blue-White Screening kenne ich mich nicht gut aus, weil ich es selber nie gemacht habe. Ich habe meist Vektoren verwendet, die speziell für den Einbau von PCR-Produkten konstruiert waren (TOPO TA Cloning Kit oder TA Cloning Kit von Invitrogen). Da braucht man kein Blue-White Screening, da bei Ampicillin bzw. Kanamycin enthaltenden Nährmedien überhaupt keine Kolonien wachsen, wenn kein Insert eingebaut wurde.

So wie ich das verstehe ist der Ort des Einbaus der MCS im PUC18 Vektor so gewählt (wahrscheinlich empirisch), dass die kurze im richtigen Leserahmen mittranslatierte Sequenz am N-Terminus der ß-Galactosidase keinen großen Einfluss auf die Funktion des Enzyms hat.

Wird aber ein Insert einkloniert so ist das ja meist schon etwas größer und damit sowohl die Primär- als auch die Sekundärstruktur so stark verändert, dass das Enzym nicht mehr richtig funktionieren kann. Am besten ist es natürlich, wenn man ein Insert so wählt, dass der anschließende Leserahmen der ß-Galactosidase sich verändert. Dann ist man ganz auf der sicheren Seite.

Ich habe mir so etwas in der Art schon gedacht, wollte aber mal sicher gehen ob die Vermutung korrekt ist. Vielen Dank für deine Antwort! :-)

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@DrBorrio

Gern geschehen. Die Frage war auch gut. Die hatte ich mir selber noch nie gestellt. Daher gibt es auch ein DH. Danke für den Stern.

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Ich bin mir nicht ganz sicher was genau du wissen möchstest aber ich versteh deine Frage nun so. Die MCS steht dem Gen im Weg? Auch im puc 19 ist die MCS in der Mitte von der codierenden Sequenz. Anscheinend stört die gar nicht beim ablesen (Hat meine Leherin damals gesagt)

Ja genau, ich dachte mir, dass die MCS (die ja aus ca. 50 bp besteht) das Leseraster des Gens stört oder zumindest einige Aminosäuren zum Genprodukt (der Galactosidase) hinzufügt, und dieses infolgedessen eigentlich funktionsunfähig sein oder nur eingeschränkt funktionieren solte. In der Praxis scheint es ja tatsächlich so zu sein, dass die MCS nicht stört, aber mir ist eben nicht ganz klar warum das so ist^^

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@DrBorrio

Ich schätze das die RNA-Polymerase das berücksichtigen bzw erkennen kann und es später beim produzieren des genproduktes nicht stört, also der kleine Abschnitt an bp. Daher benutzt man puc18/19 gern für nachweise ob etwas reinkloniert werden konnte ^^ Man könnte sagen der Zufall hat das gut hinbekommen oder Gott hat es genial erschaffen ;D

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