Diese Frage ist nicht eindeutig zu beantworten, da einiges nicht klar eingegrenzt wird. Ich fange daher mit der einfachsten Situation an.
z.B. geht es um die genomische Sequenz mit Introns (was ich vermute aufgund der Größe) oder die reine Gensequenz nur aus Exons bestehend? Soll es das ganze Gen sein, oder eine Bank aus einzelnen Teilfragmenten?
Reine Gensequenz mit Exons Antwort:
Aufreinigung der mRNA, aus dieser cDNA durch reverse Transkription erstellen. Diese in bakterielle Plasmide klonieren. Anhand der 300BP Sequenze eine Sonde per PCR amplifizieren. Mit dieser Sonde die Bakterien selektieren, die das gewünschte Gen im Plasmid tragen (nach Vermehrung und Aufreinigung der Plasmide)
genomische Sequenz mit Introns, Genbank aus Teil Sequenzen:
Mit der bekannten Sequenze in der Pubmed Gendatenbank nach der kompletten Sequenz suchen. Geeignete Schnittstellen (2 verschiedene für überplappende Klone) suchen um 3-8 kb große Fragmente zu erhalten. Diese müssen kloniert werden. Dazu wird die gesamte, geschnittene DNA in Plasmide kloniert und diese in Bakterien elektroporiert. Die erhaltenen Klone werden amplifiziert und mittels Sonden die positiven Klone selektiert. Durch die Überlappung kann man die Fragmente leichter zuordnen. Sequenzierung zumindest teilweise aller Sequenzen zu Verifizierung.
Falls Gensequenz nicht in Pubmed gefunden werden kann:
Aufgereinigte genomische DNA schneiden mit verschiedenen Endonukleasen (je Ansatz ein Enzym). Da das Gen aus anderen Organismen bekannt ist, bei diesen ein Aligment der Exone vollziehen. Besonders konservierte Bereiche (50-100 Basen reichen aus) wählen und mittels PCR amplifizieren. Diese werden als Sonde (Southern Blot) verwendet um die zuvor geschnittenen und klonierten Fragmente zuzuordnen (also zum Gen gehörend oder nicht). Da wieder wenigstens zwei Endonukleasen verwendet wurden, sollten zumindest viele Bereiche überlappen. Sollten nicht alle Bereiche überlappen, können die Leerstellen gewonnen werden, in dem die flankierenden Klone sequenziert (sollte eigentlich bei allen positiven eh gemacht werden) werden und anhand dieser Sequenzen entsprechende Primer erstellt werden, mit denen man per PCR die Lücken füllen kann.
Bei dieser Methode ist die Wahl der Vektoren kaum eingeschränkt. Für bessere Beantwortung am besten auf meine Kurzformantwort eingehen. Für Rückfragen stehe ich auch zur Verfügung.