Sequenz des DNA-Fragments?
Hi,
wenn man eine bestimmte Mutation (in diesem Fall p.L14W) mittels CRISPR/Cas Methode in eine andere DNA einfügen, entfernt man ein ursprüngliches DNA Fragment und ersetzt es mit dem mutierten DNA Fragment. Doch wie ermittle ich nun die Sequenz des DNA Fragments, das gebraucht wird um die Mutation p.L14W in die ZielDNA einzufügen?
Ich weiß, dass das DNA Fragment doppelsträngig sein muss und die Mutation p.L14W im Zentrum haben muss. An beiden sind 20 Nukleotide zu finden, die der ursprünglichen DNA entsprechen.
Die Mutation p.L14W ist eine Mutation auf der Ebene eines Proteins und das Leucin an Position 14 wird durch Tryptophan ersetzt (glaube ich zumindest).
Ich habe nun also herausgefunden, was das DNA-Fragment für Eigenschaften haben muss und was die Mutation p.L14W eigentlich heißt, aber finde nun keinen Weg die Sequenz des DNA Fragments herauszufinden. Ich freue mich über jegliche Antworten oder Lösungsansätze.
LG
2 Antworten
Wenn es dir nur darum geht, die Mutation einzufügen, sollte dein restliches DNA - Fragment gleich dem Ziel sein (WT der DNA ohne Mutation).
Wenn du zusätzlich noch anstelle von Cas9 Cpf1 verwendest, kannst du dir sticky-ends zur Nutze machen im Gegensatz zu Blunt Ends.
Du brauchst eine Erkennungssequenz, an der CRISPR/Cas9 bindet und schneidet, also eine Sequenz, die die betreffende "Fehlstelle" sozusagen flankiert. Sie muss komplementär zur crRNA sein, die dann bindet. Die Erkennungssequenz ist in der Regel bekannt, da das Genom des Menschen vollständig entschlüsselt ist und damit "ganz einfach" in einer Datenbank danach gesucht werden kann.