Frage von xy121, 57

Wie funktioniert die DNA-Chip-Technologie?

Hallo! Der DNA-Chip funktioniert ja mit dem Prinzip der DNA-Hybridisierung oder? Aber wie genau funktioniert dies? Man hat also einen kleinen Chip, auf dem viele CDNA aufgetragen sind. Die Position ist bekannt. Nun überträgt man z.B. die Gene (CDNA) eines Menschen mit Erbkrankheit auf diesen Chip. Wie erkennt man jetzt, dass der Mensch diese Erbkrankehit hatte?

Iwo gab es auch ein Beispiel wo 2 Einzelstränge unterschiedlich gefärbt wurden. An manchen Stellen leuchtete nach der Hybridisierung beide Farben in einer Mischfarbe auf?! Was ist das für ein Prinzip? Verwechsel ich was??? Danke euch!!!

Antwort
von MoeS1973, 26

Du wirfst da einige Sachen ducheinander. Grundsätzlich muss man zwischen zwei Arten von Chps unterscheiden: Die für Expression, und die für CGH (Comparative genomic hybridization) bei denen man Deletionen und Amplifikationen messen kann..
Zu den Expressions Arrays (Ich beschreibe hier nur die gängigste Methode): Aus dem Untersuchungsgut wird die RNA isoliert und mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben. Während der reversen Transkription wird künstlich in die cDNA ein Transkriptionsstartpunkt für eine virale RNA Polymerase eingefügt. Die cDNA mit dem künstlichen Transkriptionsstartpunkt wird isoliert, und wieder in RNA umgeschrieben, das ist die sog. cRNA. Das hat 2 Vorteile:
1) Die RNA aus dem Untersuchungsgut wird vermehrt
2) RNA hybridisiert mit DNA besser als DNA mit DNA

Während der zweiten Umschrift wird in die RNA eine Markierung eingefügt, entweder Biotin oder ein fluoreszierender Farbstoff.

Zu dem Chip: Auf dem Chip, auch Array genannt, befinden sich DNA Fragmente. Von den Fragmenten weiss man an welcher Position sich welches Fragment befindet. Wenn man die markierte cRNA nun auf den Array gibt, hybridisieren die komplementären Bereiche auf dem Chip mit der cRNA. Wieviel cRNA an welcher Stelle hybridisiert hat kann man mit einem Scanner messen.
Bei einigen Arrays wird zusammen mit der cRNA aus dem Untersuchungsgut eine zweite cRNA aus einem Referenzmaterial hybridisiert. Die Referenz cRNA trägt eine andere Markierung. Das hilft wenn man Proben direkt vergleichen will.

Zu den CGH Arrays. Hier werden 2 DNAs unterschiedlich markiert. Eine stammt von einem zu untersuchenden Patienten, und eine von einem Gesunden (oder ist ein Gemisch aus mehreren DNAs gesunder Probanden) als Referenz. Die verschiedenfarbig markierten DNAs verden zusammen auf einen Chip gegeben, wobei man wieder die Art und Position der DNAs die auf dem Chip gebunden sind kennt. Ist alls normal, werden  Referenz- und Patienten- DNA in gleichem Ausmaß an eine bestimmte Stelle auf dem Chip binden. Liegt bei dem Patienten eine Amplifikation in einem Bereich vor, ist ist mehr von der DNA der betreffenden Patienten DNA in dem Gemisch. Es wird also auch mehr Patienten DNA auf dem Berteich des Chips binden, der diese Stelle in Genom repräsentiert. Wenn die Patienten DNA grün markiert ist, wird die Stelle also ehr grün leuchten Bei einer Deletion ist das Gegenteil der Fall, die Stelle würde also ehr in der Farbe der Referenz-DNA leuchten.

Diese Mischfarbe die Du beschreibst wird am PC erzeugt. Im Normalfall werden die Chips so gecannt dass nur einer der Fluoreszenzfarbstoffe aufgenommen wird. Das gleiche wird anschließend für den 2. Farbstoff gemacht. Oft verwendete Farben sind Cy3 (leuchtet grün) und Cy5 (leuchtet rot) Als "echtes" Gemisch käme da ein Ton in Richtung Oliv raus, es wird mit den gängigen Array-PC Programmen aber gelb dargestellt.

Kommentar von xy121 ,

Vielen Dank! Also wenn ich jetzt z.B. die DNA des kranken Patienten grün färbe und die des gesunden gelb, und an einer Stelle mehr grün vorhanden ist, dann hat die DNA des Patienten mehr identische Basen in Bezug auf den Hybrid-Strang auf dem Chip? Und warum ist das interessant zu wissen, ob ein Strang mehr bindet oder nicht?

Kommentar von MoeS1973 ,

Das stimmt soweit. Interessant ist das für bestimmte Erbkrankheiten. Als einfaches Beispiel könnte man Trisomie 18 oder 21 nennen, bei denen eine größere Kopienzahl eine Erkrankung auslöst. Dafür würde keiner einen Array machen weil es schnellere und billigere Methoden gibt, aber als bekanntes Beispiel sollte das reichen.
In der Praxis werden oft Arrays verwendet, wenn man auf konventionelle (klassische CGH, vielfarb-FISH)  Art keine Veränderungen finden kann.
Eine Indikation können sein: Behinderung eines Kindes, ohne bekannten Grund. Hier spielen oft relativ kleine Deletionen oder Amplifikationen eine Rolle.

Antwort
von Pramidenzelle, 33

Meines Wissens gibt es inzwischen schon unterschiedliche Arten, wie DNA-Chips (Microarrays) ausgewertet werden können, aber ich glaube ich weiß, auf welche Methode du anspielst, nämlich auf FRET (Förster Resonanz Energie Transfer).

Dabei hat man, wie du bereits richtig gesagt hast, bekannte DNA, die auf dem Chip immobilisiert ist. Dabei handelt es sich allerdings nicht um cDNA, sondern um DNA, die zu den zu testenden Sequenzen komplementär ist. Nachdem man die Probe mittels PCR amplifiziert hat, gibt man sie auf den Chip und es kommt zur Hybridisierung, wenn die Sequenzen komplementär sind. So kann man z.B. auf einem Chip ein Feld für das "gesunde" und eins für das "mutierte" Allel haben. Oft sind die beiden sich zwar noch ähnlich genug, dass es in beiden Fällen zur Hybridisierung kommen kann. Allerdings wird bei der genau passenden Sequenz mehr Hybridisierung stattfnden, als bei der beinahe-passenden. Vermutlich kann man das auch noch entsprechend optimieren, aber das fällt wohl unter Firmengeheimnisse der Hersteller.

Die Proben werden dann fluoreszenzbasiert ausgelesen. Eine Methode dazu, FRET, funktioniert so, dass man die DNA auf dem Chip mit einem Donor-Fluorophor markiert und die zu testende DNA mit einem Akzeptor-Fluorophor.

Wenn keine Hybridisierung stattgefunden hat, dann ist der Donor allein und wird, wenn er mittels Laser angeregt wird, Licht einer bestimmten Wellenlänge aussenden (sagen wir Mal grün).
Hat die Hybridisierung allerdings stattgefunden kann die Energie mehr oder weniger Effizient an den Akzeptor übertragen weden, der bei gleicher Anregung (!) bei einer anderen Wellenlänge emmitiert (sagen wir Mal rot). Dann braucht man nur nur auswerten:
An den grünen Positionen hat keine Hybridisierung stattgefunden, an den roten schon. Da man ja weiß, welche DNA sich in welchem Feld befindet, kann man so ermitteln, was sich in der Probe befindet.
Da diese Energieübertragung allerdings nicht mit 100%iger Effizienz funktioniert, wird auch bei den "positiven" aka roten Feldern trotzdem noch etwas grünes Licht zu detektieren sein, allerdings bekommt man grün und rot, als zwei bestimmte Emmissionsspektren, nicht irgendeine zufällige Mischung.

Das ist zwar nicht die einzige, mögliche Art der Detektion, aber ich schätze, es ist die, von der du in deinem Beispiel gehört haben könntest.

Ich hoffe, ich konnte dir ein wenig weiter helfen
Lg Pramidenzelle

Kommentar von MoeS1973 ,

Ich will dir nicht zu Nahe treten, aber bei Nukleinsäure Microarrays spielt FRET, außer ggf. als Störfaktor, keine Rolle. Die einzigen Arrays bei denen man sich FRET zu Nutze macht sind Protein-Interaktions Arrays.
Die beiden mit Abstand am häufigsten verwendeten Farbstoffe für Arrays sind Cy3 und Cy5. Cy3 emmitiert Licht bei ca. 570 nm Cy5 wird bei ca. 650 nm angeregt. Da ist der Energietransfer so klein, dass er in der Praxis keine Rolle spielt.

Kommentar von Pramidenzelle ,

Keine Sorge, zu mit mehr-wissen tritt man mir nicht zu nahe :D

Ich hab Microarrays bisher nur in der Theorie gehört und noch nicht selbst benutzt, aber da ich nebenbei grade auch noch die FRET-Vorlesung gehört habe, erschien mir das als als Nachweismethode für ein Beispiel, in dem beide Stränge markiert wurden logisch... Wieder was gelernt.

Kommentar von MoeS1973 ,

Die Idee ist ja auch nicht dumm, scheitert in der Praxis aber daran, dass für ein FRET die beiden Fluorophore sehr nah zusammen sein müssen. Es ist aber bei weitem nicht jede Base markiert, die Abstände sind also recht gross, und außerdem nicht immer gleich. Man bekommt also keinen gleichmäßigen FRET hin. Du weisst sicherlich, dass die Transferrate mit der sechsten Potenz der Akzeptor-Donor-Distaz abnimmt.

Kommentar von Pramidenzelle ,

Ah, Danke :-)

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