Wie kann man die NADPH/H+ Konzentration genau bestimmen wenn NADP bei der Wellenlänge dennoch auch Licht absorbiert?
Im Lehrbuch wird gesagt dass man aufgrund der eines unterschiedlichen Absorptionsmaximums die NADPH/H+ Konzentration photometrisch messen kann.
Aber in der Grafik sieht man ja dass NADP bei 340nm zwar kein Maximum hat, aber dennoch nicht ganz unten auf der x-Achse bei null ist.
Wie will man dann also bei der photometrischen Messung wissen dass die Lichtabsorption auf NADPH/H+ zurück geht?
Theoretisch könnte ja die Lichtabsorption auch auf NADPH+ zurückgehen da der Extinktionskoeffizient nicht bei 0 ist.
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Aber in der Grafik sieht man ja dass NADP bei 340nm zwar kein Maximum hat, aber dennoch nicht ganz unten auf der x-Achse bei null ist.
Warum sollte denn die Absorption von NADP bei 340 nm unbedingt Null sein. Der Gehalt an NADPH berechnet sich einfach aus der Differenz der Absorption von NADP und NADPH. Angenommen man misst bei 100 % NADPH eine Extinktion von 0,800 und bei 100 % NADP 0,050. Dann kann man bei E = 0,320 doch den Gehalt an NADPH einfach bestimmen durch:
w(NADPH) = 0,320/(0,800-0,050) = 0,4267 entspr. 42,67 %
Normalerweise misst man ja bei einer enzymatischen Umsetzung im Photometer eine Reaktion, in der NADPH verbraucht wird. Man misst also 2 Extinktionswerte, bildet die Differenz und rechnet über den Extinktionskoeffizienten von NADPH die Konzentrationsänderung. Bei der Differenzbildung mittelt sich jeder Beitrag von NADP raus.