Einflüsse auf Trennung HPLC?
Hallo,
kann mir jemand weiterhelfen? Welchen Einfluss hat
1) die Analytkonzentration,
2) die Fließgeschwindigkeit und
3) die Fließmittelzusammensetzung
auf die Trennung (HPLC)? Ich bin schon stundenlang am suchen und lesen, finde aber keine gute Erklärung dazu.
Danke und viele Grüße
2 Antworten
1) die Analytkonzentration hat keinen direkten Einfluss sondern nur indirekt über Aufgabevolumen und die Aufgabemenge. Ein Trennsäule hat eine begrenzte Trennkapazität, kann also nur eine bestimmte maximale Analytmasse optimal auftrennen. Und auch das Aufgabevolumen ist limitiert und muss in einem sinnvollen Verhältnis zur Fließgeschwindigkeit des Laufmittels stehen. Eine zu hohe Masse führt dazu, dass Peaks zu breit werden und ineinander übergehen. Bei einer zu großen Überladung braucht man sehr viel Laufmittel, um die Verbindungen von der Säule überhaupt hinreichend zu eluieren. Bei zu großem Aufgabevolumen resultiert ebenfalls eine Peakverbreiterung, sodass auch dann die Trennungen schlechter werden. Bei analytischen Säulen werden Volumina von wenigen Mikrolitern bis zu vielleicht maximal 100 μL bei den dickeren und längeren Säulen. Optimal sind kleine Aufgabevolumina mit Analytkonzentrationen, die einerseits die Trennkapazität nicht überfordern und andererseits eine ausreichende Detektorresponse zu erzielen.
2) Die Fließgeschwindigkeit wird natürlicherweise durch den maximal möglichen Pumpendruck begrenzt. Hohe Flussraten führen zu schnellen Trennungen und scharfen Peaks. Zu geringe Flüsse sind bei der HPLC nicht günstig, weil dann eine Peakverbreiterung durch Diffusion eintritt.
3) Die Fließmittelzusammensetzung ist essentiell für die Trennung. Man wählt hier üblicherweise binäre Systeme, wo man einen Gradienten fährt. Der richtet sich natürlich nach der Art der stationären Phase, Normalphase, Reverse phase, Ionentauscher etc.
Es finden bei der Chromatografie ständig Gleichgewichtseinstellungen statt, wobei die Analyte zwischen stationärer und mobiler Phase verteilt werden. Das braucht eine gewisse Zeit. Wenn man nun mit einer Pumpe 100 mL des Laufmittels innerhalb von wenigen Sekunden beispielsweise durch eine normale Kieselgelsäule mit einem Volumen von vielleicht 50 mL drückt, bleibt für eine Einstellung der Gleichgewichte keine Zeit und die Probe wird nur sehr unzureichend oder nicht getrennt.
Hi,
In der HPLC hast du eine fest und eine mobile/flüssige Phase. Dein Analyt beinhaltest mindestens 2 Stoffe, von denen einer besser zur festen Phase passt, der andere zur flüssigen (zum Beispiel auf Grund der Polarität).
Ist die Analytkonzentration zu hoch, wird die entsprechende Phase überfrachtet/überlastet und du bekommst statt der richtigen RT Werte der einzelnen Bestandteile mehrere falsche RT Werte von verschiedenen Mischungen. (Gibt neben der analytischen auch die auch präperative Chromatographie. Googel mal danach)
Ist die Fließgeschwindigkeit zu hoch sinkt die Trennleistung, weil die Interaktion mit der festen Phase gestört wird.
Da die feste Phase einer Säule vorgegeben ist, kannst du die Trennleistung durch Anpassung des Fließmittels extrem beeinflussen/verbessern. Einfachstes Beispiel ist die Anpassung der polar/protischen Eigenschaften.
m.f.G.
anwesende
Ist die Fließgeschwindigkeit zu hoch sinkt die Trennleistung, weil die Interaktion mit der festen Phase gestört wird.
Das halte bei einer HPLC-Trennung nicht für den kritischen Punkt. Bei einer normalen Säulenchromatographie, die mit dem hydrostatischen Druck einer Flüssigkeitssäule und Kieselgel oder Aluminiumoxid arbeitet oder kleinen Kartuschen, die mit Unterdruck betrieben werden, ist das sicher ein entscheidender Parameter. Wenn die Elutionsgeschwindigkeit zu hoch ist, geht die Trennleistung bzw. die Adsorptionsrate in die Knie. Bei der HPLC ist m.E. üblicherweise der Gegendruck, den die Säule erzeugt, der limitierende Faktor. Jedenfalls habe ich in meinem Laborleben bei RP-HPLC-Trennungen immer knapp unter dem möglichen Maximaldruck mit guter Trennleistung gearbeitet. Das sind nur meine Erfahrungswerte, ohne dass ich das exakt mit theoretischem Background beweisen könnte.
Hallo Picus, hierbei handelt es sich um eine rein theoretische Betrachtung. Ab irgendeinem Punkt muss die zu hohe Fließgeschwindigkeit sich negativ auswirken. Ob diese überhaupt real erreichbar ist (gegen den Gegendruck der Säule) ist eine andere Frage.
Insofern hast du für das reale Leben absolut recht und jeder wird wenn möglich am maximalen Druck arbeiten. Die beste Stellschraube für eine gute Trennleistung ist und bleibt das Fließmittelgemisch.
Danke für deine Anmerkung/Erfahrung aus dem echten Leben.
Danke für deine Antwort ☺️.
Noch eine Gegenfrage zur Fließmittelgeschwindigkeit: wie könnte man erklären, dass eine Erhöhung der Fließmittelgeschwindigkeit nicht unbedingt zu einer besseren Trennung führt?