Frage von Xelo5, 56

Wie viel Folin-Ciocalteureagenz bei Proteinbestimmung nach Lowry verwenden?

Hallo,

ich bin neu in diesem Forum habe also noch nicht so viel Erfahrung ^^ Ich bitte euch um Hilfe denn ich muss für eine Wissenschaftliche Seminararbeit eine Proteinbestimmung nach Lowry durchführen. Dabei muss ich eine Biuret-Reaktion durchführen und danach die Folin-Ciocalteu-Reagenz hinzugeben, bis eine intensive Blaufärbung (Molybdänblau) eintritt.

Mein Lehrer würde jedoch gerne eine genaue Angabe haben, wie viel Folin-Ciocalteu-Reagenz ich verwenden muss davor lässt er mich keine Durchführung machen. :/

Meine Frage also: Wie viel Folin-Ciocalteu-Reagenz muss ich verwenden damit die Molybdänblau-Färbung eintritt?

Habe im Internet keine Angaben gefunden, dort steht nur etwas wie "bis eine Blaufärbung eintritt" aber mein Lehrer will eben nicht dass ich einfach so viel hinzugebe bis es blau wird sondern eine Angabe in ml ...

Bitte helft mir :(

Expertenantwort
von mgausmann, Community-Experte für Chemie, 46

Bei dieser Variante werden zu einem Anteil Proteinprobe (1.0) nacheinander drei Reagenzien A (Carbonat/NaOH-Lösung), B (alkalische CuSO4-Lösung) und C (verdünntes Folin-Ciocalteau-Reagens) gegeben (Anteile A:B:C = 0,9 : 0,1 : 3,0). [...]

Nachweisgrenze: 0.1-1 mikrogramm Protein/ml
ungefähr benötigtes Probevolumen: 1mL

Quelle: F. Lottspeich, J. W. Engels, Bioanalytik 2009, 2. Auflage, S. 38-39.

Über die genaue Konzentration des Reagens steht nichts drin, aber ich denke das ist standardisiert, müsstest du also im Internet (bei Chemikalienhändlern) schnell herausfinden können und somit deinem Lehrer mitteilen können, wieviel du benötigst.

PS: Wenn in deiner Seminararbeit viel mit Proteinbestimmung/Analytik zu tun hast, kann ich dir empfehlen, oben genanntes Buch vielleicht in der Unibib auszuleihen. Da steht eine ganze Menge dazu drin und ist das Standardwerk in dem Bereich. Wahrscheinlich habt ihr für eure Seminararbeit ja einen Account dort bekommen (so wars damals bei uns)

Kommentar von Xelo5 ,

Zunächst einmal vielen Dank für deine Antwort :) 

Du meinst also ich soll bei Chemikalienhändlern nachschauen wie viel ml sie von der Folin-Ciocalteu-Reagenz verkaufen?

Das Buch versuche ich zu bekommen danke für den Tipp :)

Kommentar von mgausmann ,

Naja, du musst ja wissen, in welcher Konzentration das Reagens nach der Vorschrift oben verwendet wird. Da musst du ggf. selbst verdünnen. Außerdem muss der Lehrer die Konzentration wissen, falls er das Reagenz selbst mischen möchte.

Wenn du bei Chemikalienhändlern nachschaust, wirst du feststellen, dass sie fast ausschließlich in einer Konzentration von 2N verkauft wird. Das meinte ich mit standardisiert ;)
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/f9252?lang=de®ion=DE

Also, du benötigst 3mL 2N Reagenz pro ml Proteinlösung die getestet werden soll...

Kommentar von Xelo5 ,

Ahhhh okay ^^

Ja er hat für unsere Seminararbeiten eine Sammelbestellung aufgegeben und darunter ist die Folin-Reagenz in einer Konzentration von 2N :) 

Also 3ml pro 1ml getesteter Proteinlösung (in meinem Fall Milch) 

Vielen Dank!

Kommentar von mgausmann ,

Na wenns um Milch geht, dann denk dran, eine Verdünnungsreihe zu machen, da ist viel zu viel Casein drin, um das im Photometer genau zu messen mit dem Reagenz.

Kannst das Casein zur Überprüfung auch mal mit Essigsäure ausfällen, das funktioniert quantitativ, anschließend kannst du die (Nicht-Casein)-Proteine im Filtrat quantifizieren.

Nur so als Anregung ;)

Kommentar von Xelo5 ,

Okay stimmt das habe ich noch garnicht berücksichtigt. 

Bei einer Verdünnungsreihe füllt man 10ml auf 100ml auf richtig?

Wie weit meinst du muss ich verdünnen bis ein anständiges Ergebnis raus kommt?

Kommentar von mgausmann ,

Genau...
Keine Ahnung, probiers aus ;)
Ich würde die Verdünnungsreihe einfach komplett vermessen, ist ja ne sache von Minuten, dann kannst du jeweils die Proteinkonzentration berechnen und dann siehst du sogar die Messabweichungen bei den zu hohen Konzentrationen... Irgendwann bleibt die gemessene Proteinkonzentration dann konstant, die sind dann auch einigermaßen stichhaltig. Irgendwann erreichst du die Nachweisgrenze und auch das wirst du dann in deinen Ergebnissen feststellen.

Excel ist dein Freund.

So würde man es jedenfalls machen, wenn mans wissenschaftlich angeht.

Kommentar von Xelo5 ,

Okay

Und wenn ich schon mal den Experten hab: für die Berechnung der der Proteinkonzentration brauche ich Transmission und Extinktion richtig?

Außerdem brauche ich eine Eichkurve habe ich gelesen allerdings weiß ich nicht so recht wie ich eine erstellen soll? ^^

Auf jeden fall danke für deine Antworten hast mir schon echt weitergeholfen :)

Kommentar von mgausmann ,

Du brauchst Transmission oder Extinktion. Die beiden hängen schließlich zusammen. Üblicherweise hängen beide zusammen.

Entweder eine Eichkurve, oder du nimmst einfach den Extinktionskoeffizienten für das Reagenz. Den kannst du nachlesen´, müsste auch im Datenblatt zu dem Reagenz drinstehen.
Für eine Eichkurve stellst du eine Proteinlösung bekannter Konzentration her, machst eine verdünnungsreihe, vermisst sie und erstellst daraus eine Gerade. Dadurch lässt sich dann auch der Extinktionskoeffizient des Protein-Reagenzkomplexes ermitteln. Wirst du wohl machen müssen, theoretisch wärs aber nicht nötig.

Was du auf jedenfall machen musst, ist die Basislinie jedes mal zu messen, denn Milch an sich ist natürlich schon trüb und absorbiert dadurch Licht. Aber wie man sowas mit dem Photometer macht, wird dir dein Lehrer dann schon zeigen...

Kommentar von Xelo5 ,

oder du nimmst einfach den Extinktionskoeffizienten für das Reagenz

Also brauche ich den Extinktionskoeffizienten für die Folin Reagenz?

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