Reverse Transkriptase
Hallo zusammen, ich schreibe heute Nachmittag eine Kursarbeit in Fach Biologie. Unser Thema ist u a Gentechnik. Ich bin wegen folgender Sache etwas verwirrt: ich habe den Prozess kennengelernt, bei welchem man menschliche DNA mit Restriktionsenzymen schneidet und den daraus entstehenden Abschnitt in einen Vektor einpflanzt. Jetzt kommt aber die Reverse Transkriptase, deren Anwendung damit begründet wird, Bakterien könnten keine introns aus dem DNA-Abschnitt herausschneiden. Mit welcher Methode wird die DNA jetzt eingepflanzt? Mit der reversen Transkriptase oder den Restriktionsenzymen ??? Danke im Voraus
3 Antworten
ich habe vor 2 Monaten mein bio-Abi geschrieben und soweit ich weiß gibt es zwei Methoden um du entsprechende dna-Sequenz, welche "eingepflanzt" werden soll zu gewinnen:
1. durch restriktionsenzyme
2. durch Reverse transkriptase: durch diese gewinnt man aus der mrna eine cDNA-sequenz
-> die durch 1. oder 2. gewonnene Sequenz wird in ein Plasmid integriert, dieser dient als vektor
ja es gibt 2 Möglichkeiten und man kann sich eine aussuchen bzw wenn die mrna eher schlecht zu isolieren ist (zB bei prokaryoten) dann nimmt man 1.
Man braucht in vielen Laboren eben oft ein Gen, welches man aus einem Mehrzeller isolieren und einem Einzeller einpflanzen will. Da es jedoch ein paar Unterschiede zwischen mehrzelliger DNA und einzelliger DNA gibt (siehe: Exons u. Introns), bedient man sich eines Tricks. Und zwar isoliert man nicht einfach das Gen direkt aus der DNA des Mehrzellers, sondern man isoliert die abgelesene RNA des Gens. Diese RNA besitzt im Gegensatz zur DNA keine Introns. Um aus der RNA eine DNA herzustellen, die man dem Bakterium einpflanzen kann, benötigt man jedoch eine Reverse Transkriptase, die die RNA in eine DNA umschreibt. Ist dies in einer RT-PCR geschehen, so erhält man eine DNA, die für das gewünschte Protein codiert und keine Introns mehr enthält.
Genau. Und die Primer, die in der PCR eingesetzt wurden können beispielsweise so designed worden sein, dass das PCR-Produkt an beiden Enden Schnittstellen für ein Restriktionsenzym besitzt. Diese Enden können dann durch die Enzyme geschnitten und das DNA-Stück dann in einen Vektor eingefügt werden.
Es gibt aber auch eine schnelle Alternative zu dieser Methode:
Verwendet man bestimmte Taq-Polymerasen bei der RT-PCR so erhält jedes Ende der PCR-Produkte einen A-Überhang also einen Adenosin-Überhang am 3´-Ende beider DNA-Stränge. Ein entsprechender Vektor hat den komplementären Thymidin-Überhang. Beide können mit Hilfe einer Topoisomerase zusammen ligiert und dann in Bakterien transformiert werden. Das Ganze spielt sich in weniger als 1 Stunde ab. Siehe TA-Klonierung oder TOPO TA Klonierung.
Restriktionsenzyme sind, wie du bereits gesagt hast, Enzyme, die DNA an ganz spezifischen Stellen schneiden können und die diese somit in Fragmente zerlegen. Der Einbau eines solchen Fragments in einen Vektor geschieht mit Hilfe der Ligase in vitro. Rekombinante Plasmide können dann in Zellen (meist E. Coli) gebracht werden, die dann das zu untersuchende Gen (in vivo) exprimieren, bzw. vermehren.
Die Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, bildet also komplementär an einen RNA Strang, einen DNA-Strang. Bei der RNA handelt es sich meist um eine mRNA. Die reverse Transkription bildet also einen DNA-Abschnitt (ein Gen), der keine Introns enthält. Somit lässt sich ein Gen isolieren, dass dann wie oben beschrieben in einen Vektor gepackt werden kann und in einer Zelle vermehrt wird. Die reverse Transkription funktioniert sowohl in vitro, als auch in vivo. Man benötigt nur das Enzym.
Die Methode mit der nun DNA "eingepflanzt" wird nennt sich übrigens Transformation (bzw. Transfektion). Die beschrieben Enzyme (Restriktionsenzyme und RT) dienen lediglich der Vorarbeit, um eine Transformation durchführen zu können. Was dazu alles nötig ist, kommt auf das Experiment an. Alternative kann man auch eine PCR machen, um DNA-Abschnitte zu clonieren. Das geht schneller.
LG
Ja die Frage ist nur, wann mit der 1. und wann mit der 2.