Frage von Baba2211, 17

Hallo! Es geht um die Enzymaktivitäten von F-1,6-bisphosphatase unter verschiedenen Bedingungen. Kann mir jm bei den Kalkulationen unter die Arme greifen?

Im Labor wurde die Aktivität von F-1,6-bisphosphatase untersucht, einmal reprimiert, einmal nicht. Es wurden zu diesem Zweck 2 Kulturen angesetzt:

  • YPD (Absorption: 0.348; c = 5.568 mg/mL; m = 6.96 mg (*8 mL))
  • YPG (Absorption: 0.104; c = 1.664 mg/mL; m = 2.08 mg (*8 mL))

8mL von diesen Kulturen wurden verwendet, um Proteinextrakte zu machen.

  • Extrakt 1: 320 µL
  • Extrakt 2: 320 µL

Eine Standard BSA Kurve wurde gemacht und die lineare Funktion dazu ermittelt:

f(x) = 1.9323x + 0.0057

Die Absorptionen der beiden Extrakte ergab:

  • Extrakt 1: 0.034
  • Extrakt 2: 0.128

Nach x umgestellt und die beiden Absorptionen für y eingesetzt, wurden folgende Konzentrationen kalkuliert:

  • c (1) = 0.01465 mg/mL
  • c (2) = 0.0633 mg/mL

Da 2 µL für das Assay benutzt wurden, ergaben sich folgende Massen:

  • m (1) = 0.01465 mg/mL * 0.002 mL = 2.93 * 10^-5 mg
  • m (2) = 1.266 * 10^-4 mg

Im nächsten Schritt wurden 2 Kuvetten vorbereitet mit jew. einem Totalvolumen von 1094.6 µL, wovon 50 µL Enzymextrakt waren. Die Absorptionen wurden in den ersten 10 Min der Reaktion in 0.5-Min-Schritten gemessen. Anschließend wurden die Absorptionsdaten in Abhängigkeit von der Zeit graphisch dargestellt und die Steigung (deltaA/min) ermittelt.

deltaA/min = 0.0506 (1. Extrakt); 0.0186 (2. Extrakt)

Dann wurden die Enzymaktivitäten sowie die spez. Enzymaktivitäten errechnet:

deltaA/l * e (NADPH) * Tot. Vol. * 10^6 [µmoles/min oder U]

Extrakt 1 (YPG):

  • Enzymaktivität = 0.0506 min^-1/6220 Lmol^-1cm^-1 = 8.135 * 10^-6 M/min *1.0946 * 10^-3 L = 8.9046 * 10^-9 moles/min * 10^6 = 8.9046 * 10^-3 µmoles/min = 8.9046 * 10^-3 U = 8.9046 mU

  • Spez. Enzymaktivität = 8.9046 mU/(2.93 * 10^-5 mg) = 303911.3 mU/mg

Extrakt 2 (YPD):

  • Enzymaktivität = 0.0186 min^-1/6220 Lmol^-1cm^-1 = 2.9904 * 10^-6 M/min *1.0946 * 10^-3 L = 3.2733 * 10^-9 moles/min * 10^6 = 3.2733 * 10^-3 µmoles/min = 3.2733 * 10^-3 U = 3.2733 mU

  • Spez. Enzymaktivität = 3.2733 mU/(1.266 * 10^-4 mg) = 25855.5 mU/mg

So, das war lang ... dies sind meine Ergebnisse. Ich bin mir eigentlich hinsichtlich jedem Ergebnis sicher, bis auf die spezifischen Enzymaktivitäten. Ich werde das Gefühl nicht los, dass ich etwas übersehen habe zu tun, da die Werte unerwartet hoch sind. Ich hoffe, dass ihr mir dabei helfen könnt. Es würde mir bereits helfen, wenn man mir sagt "Es hat alles seine Richtigkeit so!". Falls etwaige Unklarheiten aufkommen, werde ich mein Bestes tun, sie zu beseitigen :) Schönen Gruß und schon mal ein großes Danke an alle Hilfsbereiten!

Antwort
von Bevarian, 10

Hau mal Jobul oder Quandt an - ich bin schon so gut wie auf dem Weg zum Weihnachtsmarkt...

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