Frage von SakuraKurosaki, 281

Bakterien Nachweis durch PCR-Test?

Hallo, ich arbeite grade an einer Hausarbeit über das Thema Chlamydien. Ich habe die Diagnose durch den PCR-Test nicht ganz verstanden und finde auch nichts passendes zu meiner Frage im Internet. Beim PCR-Test wird direkt nach dem Nachweis von RNA durch Polymerase-Kettenreaktion gesucht. Die Kettenreaktion wird durchgeführt, um einen kurzen Teil des DNA Stranges durch ein Enzym (genannt DNA-Polymerase) zu vervielfältigen. Super, dann haben wir eine Vielzahl von DNA Stränge, aber woher weiss man jetzt, dass das Bakterium vorhanden ist? Woher weiss man, dass der Patient nun wirklich eine Infektion hat?

Antwort
von dadita, 196

Also bei einer PCR amplifizierst du DNA, nicht RNA. Es geht zwar auch mit RNA, bzw cDNA, aber das kst wesentlich umständlicher und bedarf einiger zusätzlicher Schritte und Enzyme, zudem ist es für einen einfachen Nachweis schlicht nicht notwendig ;) 

Für eine PCR braucht neben Polymerase auch Primer, kleine DNA-Fragmente welche an spezifische DNA-Segemnte, z.B. im Chlamydien-Genom, binden.

 Ich habe das Verfahren schon gefühlte hundert mal gemacht, ich gebe mal einen Ablauf von A bis Z, wenn du etwas noch genauer wissen musst, frag nur. 

Beginnen tut alles mit der Probe, in der die Bakterien, z.B. Chlamydien nachgewiesen werden sollen, z.B. beliebiges Gewebe, Blut etc.

Diese wird homogenisiert und die gesamte DNA in der Probe extrahiert. Die gesamte DNA, also der DNA der Körperzellen (also menschliche DNA bei einem Menschen) sowie die DNA aller Mikroorganismen die auf oder in diesen gelebt haben. Auch die der Chlamydien, so denn welche in der Probe sind.

Die extrahierte DNA wird einer PCR unterzogen, es werden also Primer und Polymerase, sowie Puffer mit Salzen und Basen hinzugefügt. Wenn Chlamydien-DNA vorganden ist und nur dann, binden die Primer an diese und nur dann findet die PCR auch statt.

Gut, nun gehen wir davon aus du hast zwei Proben, eine infiziert und eine nicht. Nachdem du all die obrigen Schritte durchgeführt hast, hast du nun zwei PCR-Produkte, aber nur in einem hat die Reaktion stattgefunden, nur dort hast du die vervielfältigte DNA. Das Aussehen ist ident. 

Jetzt erst erfolgt die Auswertung. Dafür wird eine Gelelektrophorese durchgeführt. Dazu wird die DNA angefärbt, z.B. mit Ethydiumbromid. Die DNA wird auf ein Agerose-Gel aufgetragen und es wird elektrische Spannung angelegt. Die DNA als negativ geladenes Molekül wandert zum Pluspol. Nach einiger Zeit wird das Gel visualisiert, es wird unter UV-Licht angeschaut. Nun sieht man die Banden der DNA. Wenn eine da ist, ist die Probe positiv, wenn nicht dann nicht. 

Kommentar von SakuraKurosaki ,

Ah okey. Aber was ist mit der Antwort von TheTrollman? Also mit diesen Sequenziermaschinen und der Gensequenz?

Kommentar von dadita ,

Das hängt davon ab, du brauchst nicht das gesamte PCR Produkt für die Gelelektrophorese, 6 Microliter reichen da schon, wieviel du machst hast du selbst in der Hand. Den Rest kannst du zur Sequenzierung verwenden, zur Absicherung oder um einen bestimmten Stamm nachzuweisen, was durchaus von medizinischem Interesse sein kann. Es ist bei einem einfachen Nachweis eines Erregers aber nicht unbedingt notwendig. 

Oft reicht schon "Chlamydien-ja, nein?" aus und für die Beantwortung dieser Frage ist eine PCR+Gelelektrophorese ausreichend. Sequenzierung ist nicht eben billig und genau zu wissen welcher Chlamydien-Subspezies es nun ist, ist nicht immer nötig. Vielleicht wird es in der Humanmedizin öfter angewandt, meine Erfahrungen sind veterinärmedizinischer Natur. Auch da habe ich manche Proben sequenziert...aber nicht alle und wenn dann eher aus Forschungsinteresse. Alles zu sequenzieren wäre wohl auch in der Humanmedizin schlicht zu teuer.

Antwort
von TheTrollman, 147

Erstmal haben Bakterien ihre Erbinformation in DNA und nicht in RNA.

Bei dem Test werden selektiv markante Stücke des Bakterium millionenfach vervielfältigt, damit man sie dann in Sequenziermaschienen analysieren kann und anhand der ermittelten Gensequenz kann man bestimmen, von welchem Lebewesen sie stammt.

Würde man nicht selektiv mit der PCR verfielfältigen, würde man am Ende einen großen Prozentanteil menschlicher DNA von der Testperson oder DNA von anderen Bakterien haben, das würde das Ergebnis verfälschen

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