Frage von Chris94Creeper, 34

Aussalzen von Gelatine. Wieso gehen Proteine verloren?

Hallo, wir haben im Biologie-Praxis Unterricht den Versuch gehabt Proteine zu fällen und den Gehalt der Proteine per Fotometer zu bestimmen. Wir haben uns für aussalzen entschieden und 2% Gelatine angesetzt. In 10 ml 2% Gelatinelösung haben wir dann nach und nach 3 g Ammoniumsulfat zugegeben. Anschließend haben wir die lösung zentrifugiert. (8000rpm für 10 Minuten) Jetzt haben wir den Überstand und das Pellet getrennt und mit H2O auf 10ml aufgefüllt. Danach haben wir den Überstand und Pellet getrennt in einem Reagenzglas mit Biuret versehen (1:1) 20 Minuten inkubieren lassen und in Küvetten gegen den Reagenzienblindwert fotometriert. Aus Versuchen vorher haben wir bereits eine Eichreihe für Gelatine erstellt und eine Eichgerade gezeichnet. Anhand der Eichgerade haben wir 12% proteine im Überstand und 8% Proteine im Pellet bestimmt = 20% Proteine.

Meine Frage ist jetzt, wo sind die restlichen 80% der Proteine?? Ich habe bereits 2 Doktoren von unserer Schule gefragt, die konnten mir leider keine Antwort geben und waren auch überfragt. Eventuell hab ich hier das Glück und bekomme hier eine Nachvollziehbare Antwort :)

Antwort
von Wunnewuwu, 21

Entweder es ist nicht alles ausgefallen, oder das noch vorhandene Salz stört bei der biuret Reaktion. Eigentlich entfernt man das vorher.

Ich kenne Eichgeraden nur mit absoluten Werten (das ist ja der Sinn der Eichgeraden). Ein relativer Wert in % sagt nicht viel aus. Es kann sich bei eurem Verlust also auch um ein statistisches Problem handeln.

Wie viel Mol Protein habt ihr eingesetzt und wie viel Mol habt ihr gefällt? Sind es dann immer noch 20%? Dann würde ich mal auf das Salz tippen, das nicht entfernt wurde.

Kommentar von Chris94Creeper ,

Wir haben heute den Versuch nochmal gemacht und zwar haben wir diesmal das Ammoniumsulfat langsam (1g alle 10 Minuten. Insgesammt 3 g) zugegeben und haben die Lösung in einem Eiswasserbad gekühlt gehalten. Danach haben wir die Lösung bei ~5°C bei 8000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert und haben danach nochmal den % Wert, in Konzetration, anhand der Eichgerade bestimmt (für Pellet und Ü.S.). Diese sind diesmal eindeutig höher ausgefallen. Die Ermittelten Gesamtproteine in % lagen bei 70%. Also spielt Temperatur beim Aussalzen von Gelatine einen großen Faktor. Ich vermute das die restlichen 30 % durch das Salz beinflusst werden.

Antwort
von kgunther, 13

Mir scheint, da wurde das Volumen der beiden Fraktionen (wieder gelöstes) Pellet und Überstand nicht berücksichtigt.

Ich neheme zunächst an, die beiden Volumina waren gleich.

Dann wäre das Ergebnis, daß die Ausfällung im Verhältnis 8 : 12 wirksam gewesen ist. Es wurden also von 20 Gewichtsteilen Gelatine 12 G. ausgefällt. Wieviele Gewichtsteile vorlagen, ist ebenfalls bekannt: 20 mg (10ml 2%). Davon wurden 12 mg ausgefällt, 8 mg blieben im Überstand.

Es ist also nichts verloren gegangen.

Kommentar von Chris94Creeper ,

Dieses habe ich leider in meiner Frage nicht genau beschrieben. Die Volumen haben wir berücksichtigt. 

Sprich, wir haben das Volumina vom Pellet und vom Überstand gemessen (abgewogen, also in gramm) und mit einem Dreisatz auf die ermittelte % Konzentration der Eichgerade heruntergerechnet. Dieses haben wir auf die Gelatine bezogen, also 2% von 10 ml entspricht 0,2 gramm Gelatine. Dieses haben wir auch mit einem Dreisatz heruntergerechnet und sind auf das Ergebnis gekommen. 

Wir haben heute den Versuch nochmal gemacht und zwar haben wir diesmal das Ammoniumsulfat langsam (1g alle 10 Minuten. Insgesammt 3 g) zugegeben und haben die Lösung in einem Eiswasserbad gekühlt gehalten. Danach haben wir die Lösung bei ~5°C bei 8000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert und haben danach nochmal den % Wert, in Konzetration, anhand der Eichgerade bestimmt (für Pellet und Ü.S.). Diese sind diesmal eindeutig höher ausgefallen. Die Ermittelten Gesamtproteine in % lagen bei 70%. Also spielt Temperatur beim Aussalzen von Gelatine einen großen Faktor. Ich vermute das die restlichen 30 % durch das Salz beinflusst werden. 

Kommentar von kgunther ,

"Volumen des Pellets" bedeutet bestimmt "Volumen der Lösung, nachdem das Pellet wieder gelöst wurde".

Denn bei einem matschigen Pellet nützt es nichts, das Volumen des Matsches zu bestimmen.

10 ml einer 2%igen Lösung enthalten 0,02g Gelatine.

Aber diese Nachfragen lösen Dein Problem nicht. Ich vermute, daß niemand (außer Dir) wirklich überlegt hat, daß die Summe der Mengen an Gelatine in Pellet und Überstand 20mg entsprechen müssen. Das ist aber offensichtlich der Fall.

Die vielen Angaben in % sind verwirrend. Man muß sich jedesmal klar machen, welcher %-Anteil von welcher Gesamtmenge gemeint ist.

Wesentliches Ergebnis der Versuche ist, daß bestimmte Bedingungen der Ausfällung das Ergebnis verändern. Hoffentlich wurde euch auch erklärt, warum dies so ist.

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